摘要：2型糖尿?。═2D）可以多年未診斷，但出現(xiàn)并發(fā)癥，如皮膚傷口愈合延遲。動(dòng)物模型是近幾十年來發(fā)展起來的，以研究該病的病理進(jìn)展。鏈脲佐菌素（STZ）除了對胰島β細(xì)胞有選擇性的藥理毒性外，還被廣泛用于誘導(dǎo)糖尿病，但是沒有證據(jù)表明其對皮膚完整性的影響。與對照組相比，用STZ-高脂飲食改善的動(dòng)物表現(xiàn)出皮膚損傷，而基礎(chǔ)胰島素和甘油三酯沒有顯著變化。這些動(dòng)物的皮膚呈現(xiàn)出高水平的氧化應(yīng)激、低水平的粘附蛋白和脂質(zhì)介質(zhì)的改變，這些效應(yīng)不是由高脂飲食本身產(chǎn)生的。該體內(nèi)模型是研究糖尿病引起的皮膚損傷的相關(guān)方法。
關(guān)鍵詞：鏈脲佐菌素 糖尿病 脂類介質(zhì) 皮膚損傷 上皮完整性
簡介：糖尿病皮膚并發(fā)癥導(dǎo)致傷口延遲愈合，增加了截肢的風(fēng)險(xiǎn)；腳潰瘍是發(fā)達(dá)國家住院的主要原因，是糖尿病的主要發(fā)病率，常常導(dǎo)致疼痛、痛苦和生活質(zhì)量差。氧化應(yīng)激和脂質(zhì)含量已被認(rèn)為是破壞皮膚完整性的機(jī)制。然而，沒有報(bào)告顯示糖尿病動(dòng)物模型的皮膚局部改變。建立了幾種非遺傳小鼠模型。最廣泛使用的是基于HF飲食，有或沒有使用STZ對胰腺β細(xì)胞的化學(xué)消融。使用兩個(gè)誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型來研究皮膚狀況。
動(dòng)物：18只C57BL/6J雄性小鼠，15～21周齡（平均體重23±0.5克），分為3組。第一組飼喂LF飼料作為對照，第二組飼喂HF飼料。日糧中脂肪含量分別為10%和60%。在開始使用HF飲食方案之前5天，連續(xù)三次STZ（40 mg/kg）IP注射。將該化合物溶于0.05 M檸檬酸鹽緩沖液中，pH為4。在預(yù)處理期間對照組和HF組注射賦形劑，小鼠共存活5周。在禁食6小時(shí)后每周采集數(shù)據(jù)。測定甘油三酯和血糖水平。用超敏小鼠ELISA試劑盒測定胰島素。從動(dòng)物背部使用一次性活檢穿孔獲得直徑8mm和1mm厚度的皮膚樣品進(jìn)行體外TEER測量。樣品面朝上置于懸浮在含有1X PBS（500μL）的細(xì)胞培養(yǎng)孔內(nèi)的12mm聚碳酸酯過濾器（0.4μm孔）上，立即測量TEER。TBARS檢測試劑盒測定氧化應(yīng)激。對10%福爾馬林固定、石蠟包埋、HE和MT染色的皮膚標(biāo)本進(jìn)行組織學(xué)分析。為了測定脂質(zhì)含量，用含氘標(biāo)記的甲醇從皮膚中提取。每個(gè)樣品用水稀釋，得到最終甲醇濃度為20%，隨后用石油醚和含有0.1%甲酸的水洗滌柱。樣品用200μl含0.1%甲酸的甲醇洗脫。LC-MS/MS、電噴霧電離-TSQ量子超三重四極質(zhì)譜儀對樣品中二十碳五烯類化合物進(jìn)行定量。脂質(zhì)的分離是通過在水中用0.1%甲酸和乙腈中的0.1%甲酸實(shí)現(xiàn)的梯度梯度來實(shí)現(xiàn)的。將LC柱洗脫液直接導(dǎo)入TSQ量子超導(dǎo)體。所有化合物均在負(fù)離子極性模式下進(jìn)行分析。
結(jié)果：第二周開始喂飼含HF飼料的小鼠體重增加。用STZ（T2D小鼠）預(yù)處理的動(dòng)物顯示出早期體重減輕，隨后向與對照組一致。HF飲食誘導(dǎo)高血糖基礎(chǔ)水平，STZ從第三周起增強(qiáng)作用。STZ改善沒有改變甘油三酯和胰島素基礎(chǔ)水平，參數(shù)受HF飲食影響。糖尿病小鼠皮膚的TEER較對照組低，STZ增強(qiáng)的作用更為明顯。然而，TBARs水平僅在HF+STZ動(dòng)物的皮膚中顯著升高。肉眼觀察顯示用STZ預(yù)處理的動(dòng)物有嚴(yán)重的自發(fā)性皮膚損傷，組織切片顯示表皮萎縮，無炎性細(xì)胞浸潤或血管炎的跡象，毛囊減少。與觀察結(jié)果一致，HF和STZ小鼠皮膚ZO-1、E-Cadherin、Occludin和Claudin-4的粘附蛋白水平較低。此外，與HF和對照皮膚相比，STZ-HF小鼠皮膚中脂質(zhì)介質(zhì)DHA、EPA、12-HHT、LTC4、PD1、TXB2、6-keto-PGF1α、5-KETE、12-KETE和8,9EET的水平較低，PGD2、PGE2、9-HODE、13-HODE和7-HDoHE的含量較高。
討論：皮膚變化是由于糖尿病引起的皮膚代謝異?；蛱悄虿〔l(fā)癥，如足潰瘍導(dǎo)致的皮膚屏障受損。先前使用HF飲食模型的結(jié)果描述了與TEER減少、表皮厚度和炎癥標(biāo)志物的增加相關(guān)的輕度皮膚改變。使用STZ 1型糖尿病大鼠模型，皮膚中描述了炎癥細(xì)胞浸潤和氧化應(yīng)激的增加。此外，在T2D患者和STZ糖尿病大鼠的皮膚中已經(jīng)報(bào)道了TBARs的增加。最近在1型糖尿病小鼠模型中描述了皮膚屏障的破壞伴隨緊密連接的紊亂，其特征是ZO-1蛋白定位的改變。與前面提到的觀測一致，我們發(fā)現(xiàn)STZ-HF T2D模型中ZO-1、E-Cadherin、Occludin和Claudin-4的水平顯著降低，這種情況可能與TEER的減少有關(guān)。我們的模型將代表T2D嚴(yán)重和不可控制的血糖狀態(tài)，作為本研究提出的條件的主要觸發(fā)器。這種表型的嚴(yán)重程度可歸因于葡萄糖水平的協(xié)同作用。皮膚DHA和EPA的減少與表皮屏障的改變有關(guān)，PD1、PGF1、KETE和EET的減少與炎癥有關(guān)，TXB2指示病變，12-HHT通過BLT2受體被描述為促進(jìn)再生的脂質(zhì)介質(zhì)。另一方面，PGD2、PGE2和HODEs的局部增加與脫發(fā)、炎癥和氧化應(yīng)激有關(guān)。本研究中的數(shù)據(jù)描述了一個(gè)高度使用的動(dòng)物模型，該模型將為皮膚內(nèi)分泌學(xué)領(lǐng)域的未來研究提供證據(jù)。
結(jié)論：與對照組相比，用STZ高脂肪飲食改善的動(dòng)物表現(xiàn)出沒有明顯代謝改變的皮膚損傷。這些動(dòng)物的皮膚呈現(xiàn)出高水平的氧化應(yīng)激、低水平的粘附蛋白和脂質(zhì)介質(zhì)的改變，這些效應(yīng)不是由高脂飲食本身產(chǎn)生的。根據(jù)這項(xiàng)研究的結(jié)果和我們以前的報(bào)告，我們認(rèn)為在STZ-高脂飲食模型中，嚴(yán)重的高血糖和沒有胰島素會(huì)導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子和角質(zhì)形成細(xì)胞氧化應(yīng)激的爆發(fā)，從而激活LOX/COX依賴途徑，引起局部脂質(zhì)介質(zhì)變化與表皮完整性松動(dòng)有關(guān)，可能引起自發(fā)性皮膚損傷。
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