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PCR操作簡單、基礎(chǔ)，但是卻經(jīng)常出現(xiàn)各種失誤缺不知道為什么，下面就讓我們來聊聊這方面的問題吧！

首先，讓我們來回憶一下PCR鑒定的整個過程，主要包括樣本處理、配PCR體系、擴增、PCR產(chǎn)物電泳四個部分，接下來我們就從這幾個部分盤點PCR操作中的那些坑，請收下這份防坑指南。

1.樣本處理

PCR的第一個步驟就是處理樣本，這一步出問題后面的也就廢了。取樣后，如果不能馬上處理樣本，短期放4℃保存，長期放﹣20℃保存；此外，加完裂解液，要注意檢查樣本是否完全浸沒在裂解液中。

2.PCR體系

簡而言之，PCR體系的要求就是“加對成分加對量”，就好比做一道菜，缺了任何一種材料或者量不合適，味道就不一樣了，而對PCR而言，缺了任何一種成分或者量不對，你就別想看到漂亮的目標(biāo)條帶了。所以配體系的時候一定要專心,不要分心思考類似于今天中午吃什么這種哲學(xué)問題，注意所有的成分是否加對了，每種成分的量是否加對了。例如，酶的量很少，吸取的時候要注意有沒有吸到。

3.PCR擴增

就擴增而言，關(guān)鍵是要設(shè)計對程序，主要就是退火溫度及延伸時間。

退火溫度根據(jù)引物的Tm值而定，延伸時間按所用的酶來計算。

4.PCR產(chǎn)物電泳

終于到了令人激動的時刻，擴增好就可以進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳出結(jié)果了。當(dāng)然，在做之前你得提前把膠配好，膠的質(zhì)量好壞也會影響結(jié)果。這個環(huán)節(jié)需要注意的就是選擇合適的膠濃度，膠溶解加熱時不要過久，水分蒸發(fā)過多濃度改變，但同時要保證膠溶解徹底。添加的染液要注意檢查是否過期變質(zhì)。倒好膠后插梳子，注意除去氣泡，待膠凝固之后拔梳子要一氣呵成，然后給樣本加loading buffer，最后就可以上樣啦。

這一步我們要注意以下幾點：

1. 可以每個孔加一點loading buffer檢測膠是否有漏。特別是當(dāng)你覺得膠可能破了的時候一定要進(jìn)行驗漏；
2. 上樣的時候槍頭垂直加入，不要戳破膠孔，邊加邊抽出，防止噴涌出來，注意不要有氣泡；
3. 上一個樣換一個槍頭，防止污染；
4. 電泳液多次使用的話，最好頻繁更換，防止污染。
5.  

5.設(shè)置對照組

生物實驗一定要做對照，沒有對照就沒有說服力，而且設(shè)置對照有利于分析PCR鑒定失敗的原因。陰性對照及陽性對照所加體系與待測樣本一樣，只是加的樣本分別為無菌水及同個品系野生型小鼠的基因組模板。

陰性對照的意義：若是陰性對照也P出了條帶，說明有污染，實驗結(jié)果不可靠。

陽性對照的意義：如果陽性對照也沒P出來，說明體系、條件或是操作有問題。

接下來就給大家奉上幾張失敗的電泳圖，分析一下PCR的常見問題以及改進(jìn)的建議，PCR成功的原因只有一個，而失敗的原因卻千千萬，真是讓人頭大，所以大家千萬不要學(xué)我，每個步驟都要細(xì)心謹(jǐn)慎，祝大家都能跑出漂亮的條帶。

常見問題及建議

1.沒有條帶

原因1.1 ：樣本。樣本放置太久失效；樣本裂解步驟出問題，比如組織沒有浸沒到裂解液中；樣本有裂解到但是DNA濃度低，跟取樣有關(guān)，毛發(fā)太多組織太少，會導(dǎo)致裂解不出太多DNA。

建議：當(dāng)然是重新取樣提取DNA了，取樣大小適中，裂解時注意組織是否完全浸沒到裂解液中。

原因1.2： PCR反應(yīng)體系。少加酶、引物、dNTP、緩沖液等均會導(dǎo)致目標(biāo)片段擴增不出來。

建議：配體系加樣時，自行開啟勿擾模式，心無雜念，心里默念：每種成分都加了嗎？量都加對了嗎？

原因1.3： 操作問題。比如是否把酶放置在冰上，常溫放置過久會使酶失活；加各體系的時候，是否有吸取到再加進(jìn)去。

建議：記住冰在酶在，即使是融酶也要放冰上融，拿手握住酶或是常溫放置，被老板看見是要被打的。

2.抹帶

PCR擴增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。

原因：往往是由于酶量過多或酶的質(zhì)量差、dNTP濃度過高、Mg²⁺濃度過高、退火溫度過低、或循環(huán)次數(shù)過多及引物不特異等引起的。

建議：減少酶量或換另一來源的酶；減少dNTP的濃度；適當(dāng)降低Mg²⁺濃度；增加模板量；減少循環(huán)次數(shù)。最有效的方法就是提高退火溫度，或者更換引物（引物不特異也會造成抹帶）。

3.條帶比較暗

原因3.1：酶。

建議：條帶弱的情況加多酶量，一半都能得到改善。實驗表明，PCR酶對DNA具有一定的偏好性，如果使用一種酶經(jīng)過優(yōu)化也難以獲得理想擴增時，可以嘗試別的PCR酶。

原因3.2：模板、引物。

建議：確保模板和引物的品質(zhì)，保證沒有降解。用合適的試劑盒回收樣本，或者進(jìn)行膠回收得到純凈的DNA樣本是不錯的選擇，或者直接加多模板，提高反應(yīng)體系中DNA的濃度。

原因3.3：反應(yīng)體系與條件

建議：增強循環(huán)數(shù)、降低退火溫度、適當(dāng)升高M(jìn)g²⁺工作濃度，都可以提高擴增效率，但同時會導(dǎo)致特異性下降，需要根據(jù)具體的實驗要求優(yōu)化合適的條件。

PCR失敗的原因千千萬，操作情況因人而異，所以實驗小白們在操作時可以請師兄師姐幫忙看一下，他們會發(fā)現(xiàn)許多你都注意不到的操作錯誤，及時糾正過來就好了，不然每次操作都出同樣的錯誤，而自己又不知道錯在哪，覺得自己是按著步驟和要求來做的啊，怎么就出問題了，反復(fù)操作還是這樣，簡直讓人懷疑人生。