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單克隆抗體的定義及制備流程(圖)

2018-01-17 13:41 來源：項(xiàng)目加盟網(wǎng) 瀏覽量:621

基爾頓

投資金額：3-5萬

企業(yè)名稱：基爾頓生物科技（上海）有限公司

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單克隆抗體技術(shù)一種免疫學(xué)技術(shù)，將產(chǎn)生抗體的單個B淋巴細(xì)胞同骨髓腫瘤細(xì)胞雜交，獲得既能產(chǎn)生抗體，又能無限增殖的雜種細(xì)胞，并以此生產(chǎn)抗體。是僅由一種類型的細(xì)胞制造出來的抗體，對應(yīng)于多克隆抗體、多株抗體——由多種類型的細(xì)胞制造出來的一種抗體。

（1）抗原制備。制備單克隆抗體的免疫抗原，從純度上說雖不要求很高，但高純度的抗原使得到所需單抗的機(jī)會增加，同時可以減輕篩選的工作量。因此，免疫抗原是越純越好，應(yīng) 根據(jù)所研究的抗原和實(shí)驗(yàn)室的條件來決定。一般來說，抗原的來源有限，或性質(zhì)不穩(wěn)定，提純時易變性，或其免疫原性很強(qiáng)，或所需單抗是用于抗原不同組分的純化或分析等，免疫用的抗原只需初步提純甚至不提純，但抗原中混雜物很多，特別是如果這些混雜物的免疫原性較強(qiáng)時，則必須對抗原進(jìn)行純化。檢測用抗原可以是與免疫抗原純度相同，也可是不同的純度，這主要決定于所用篩檢方法的種類及其特異性和敏感性。

（2）免疫動物的選擇。根據(jù)所用的骨髓瘤細(xì)胞可選用小鼠和大鼠作為免疫動物。因?yàn)?，所有的供雜交瘤技術(shù)用的小鼠骨髓瘤細(xì)胞系均來源于BALB/c小鼠，所有的大鼠骨髓瘤細(xì)胞都來源于LOU/c大鼠，所以一般的雜交瘤生產(chǎn)都是用這兩種純系動物作為免疫動物。但是，有時為了特殊目的而需進(jìn)行種間雜交，則可免疫其他動物。種間雜交瘤一般分泌抗體的能力不穩(wěn)定，因?yàn)槿旧w容易丟失。就小鼠而言，初次免疫時以8-12周齡為宜，雌性鼠較便于操作。

單克隆抗體的定義及制備流程（圖）_1

（3）免疫程序的確定。免疫是單抗制備過程中的重要環(huán)節(jié)之一，其目的在于使B淋巴細(xì)胞在特異抗原刺激下分化、增殖，以利于細(xì)胞融合形成雜交細(xì)胞，并增加獲得分泌特異性抗體的雜交瘤的機(jī)會。因此在設(shè)計免疫程序時，應(yīng)考慮到抗原的性質(zhì)和純度、抗原量、免疫途徑、免疫次數(shù)與間隔時間、佐劑的應(yīng)用及動物對該抗原的應(yīng)答能力等。沒有一個免疫程序能適用于各種抗原。現(xiàn)用的免疫程序中多數(shù)是參照制備常規(guī)多克隆抗體的方法。表6-1列舉了目前常用的免疫程序。免疫途徑常用體內(nèi)免疫法包括皮下注射、腹腔或靜脈注射，也采用足墊、皮內(nèi)、滴鼻或點(diǎn)眼。最后一次加強(qiáng)免疫多采用腹腔或靜脈注射，目前尤其推崇后者，因?yàn)榭墒箍乖瓕ζ⒓?xì)胞作用更迅速而充分。在最后一次加強(qiáng)免疫后第3天取脾融合為好，許多實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果表明，初次免疫和再次免疫應(yīng)答反應(yīng)中，取脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，特異性雜交瘤的形成高峰分別為第4天和第22天，在初次免疫應(yīng)答時獲得的雜交瘤主要分泌IgM抗體，再次免疫應(yīng)答時獲得的雜交瘤主要分泌IgG抗體。筆者體會陽性雜交瘤出現(xiàn)的高峰與小鼠血清抗體的滴度并無明顯的平行關(guān)系，且多在血清抗體高峰之前。因此，為達(dá)到最高的雜交瘤形成率需要有盡可能多的漿母細(xì)胞，這在最后一次加強(qiáng)免疫后第3天取脾進(jìn)行融合較適宜。已有人報道采用脾內(nèi)免疫，可提高小鼠對抗原的免疫反應(yīng)性，且節(jié)省時間，一般免疫3天后即可融合。

細(xì)胞融合：首先制備細(xì)胞培養(yǎng)基、氨基喋呤（A）貯存液、次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷（HT）貯存液等各種細(xì)胞生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)。然后制備髓瘤細(xì)胞和脾淋巴細(xì)胞，之后進(jìn)行細(xì)胞融合。在細(xì)胞融合后選擇性培養(yǎng)過程中，由于大量骨髓瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞相繼死亡，此時單個或少數(shù)分散的雜交瘤細(xì)胞多半不易存活，通常必須加入其他活細(xì)胞使之繁殖，這種被加入的活細(xì)胞稱為飼養(yǎng)細(xì)胞。飼養(yǎng)細(xì)胞促進(jìn)其他細(xì)胞增殖的機(jī)制尚不明了，一般認(rèn)為它們可能釋放非種屬特異性的生長刺激因子，為雜交瘤細(xì)胞提供必要的生長條件；也可能是為了滿足新生雜交瘤細(xì)胞對細(xì)胞密度的依賴性。