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伊萊特（活性微礦）抗菌實(shí)驗(yàn)

檢測(cè)單位:        河南省農(nóng)科院畜牧所   

檢測(cè)樣品:        伊萊特（活性微礦）   

檢驗(yàn)類別:          藥敏檢測(cè)          

 

報(bào)告日期:         2017年8月4日        

伊萊特（復(fù)合礦物）檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

1.實(shí)驗(yàn)日期：2017年7月1日-2017年7月31日

2.送檢單位：韓國龍宮伊萊特株式會(huì)社

3.實(shí)驗(yàn)?zāi)康?檢測(cè)伊萊特（活性微礦）對(duì)豬大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）、豬鏈球菌（Streptococcus suis,SS）、豬沙門氏菌（Paratyphoid of  pigs,SC）和豬副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，HPS）的影響，以及對(duì)比其他藥物其效果如何。

4.實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)：河南省農(nóng)科院畜牧所

5.實(shí)驗(yàn)員：朱文豪 張青嫻 王治方

6.實(shí)驗(yàn)方法

6.1 實(shí)驗(yàn)材料

伊萊特（活性微礦）由韓國龍宮伊萊特株式會(huì)社提供；大腸桿菌、鏈球菌、沙門氏菌及副豬嗜血桿菌由河南省農(nóng)科院畜牧所提供；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD） 由廣州鼎國生物有限公司提供；乳牛血清購自北京四季青生物試劑有限公司；麥康凱培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）和胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）培養(yǎng)基均購自北京陸橋技術(shù)有限公司；DNA 提取試劑盒等購自大連寶生物公司；SS培養(yǎng)基和藥敏紙片購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

6. 2 伊萊特（活性微礦）藥敏片的制備

6. 2.1藥敏片的制備：取定性濾紙，用打孔機(jī)打成6毫米直徑的圓形小紙片，取圓紙片50片放入清潔干燥的青霉素空瓶中，瓶口以單層牛皮紙包扎，經(jīng)15磅15-20分鐘高壓消毒后，放在37℃溫箱或烘箱中數(shù)天，使完全干燥。

6. 2.2藥液的制備（用于商品藥的試驗(yàn)）：按伊萊特（活性微礦）改善量0.2-0.3%配制藥液。及1000ml水2-3g藥，配制藥敏片所用的藥液，使每個(gè)藥敏片含量達(dá)到50ug/片。

6. 2.3抗菌藥紙片制作：在上述含有50片紙片的青霉素瓶?jī)?nèi)加入藥液適量，并翻動(dòng)紙片，使各紙片充分浸透藥液，翻動(dòng)紙片時(shí)不能將紙片搗爛。同時(shí)在瓶口上記錄藥物名稱，放37℃溫箱內(nèi)過夜，干燥后即密封，切勿受潮，置陰暗干燥處存放，有效期3-6個(gè)月。

6.3 病原菌的復(fù)蘇培養(yǎng)

將凍干粉的各個(gè)菌種從超低溫冰箱拿出，加1mL無菌生理鹽水混勻之后培養(yǎng)基接種。將大腸桿菌接種在普通瓊脂上或者麥康凱培養(yǎng)基上、鏈球菌接種在TSA 培養(yǎng)基上、沙門氏菌接種在SS培養(yǎng)基上、副豬嗜血桿菌病接種在0.001%NAD 和 5% 乳牛血清的TSA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)。37℃培養(yǎng)24h可見大腸桿菌、鏈球菌、沙門氏菌生長(zhǎng)；培養(yǎng)36-48 h可見副豬嗜血桿菌生長(zhǎng)。

6.4藥敏試驗(yàn)

6.4.1劃線接種

在“超凈臺(tái)”（或自制無菌操作臺(tái)）中，用（酒精燈）經(jīng)火焰滅菌的接種環(huán)從病料中挑取適量細(xì)菌培養(yǎng)物，以劃線方式將細(xì)菌涂布到平皿培養(yǎng)基上。具體方式：用滅菌接種環(huán)取適量細(xì)菌分別在平皿邊緣相對(duì)四點(diǎn)涂菌，以每點(diǎn)開始劃線涂菌至平皿的1/2，然后找到第二點(diǎn)劃線至平皿的1/2，依次劃線，直至細(xì)菌均勻密布于平皿。（另：可將待試細(xì)菌于少量生理鹽水中制成細(xì)菌混懸液，將少量混懸液倒入平皿培養(yǎng)基上，輕晃平皿使鋪勻，放置5-10min）。

6.4.2貼藥敏片

將鑷子于酒精燈火焰滅菌后略停，取藥敏片貼到平皿培養(yǎng)基表面。為了使藥敏片與培養(yǎng)基緊密相貼，可用鑷子輕按幾下藥敏片。為了使能準(zhǔn)確的觀察結(jié)果，要求藥敏片能有規(guī)律的分布于平皿培養(yǎng)基上，一般可在平皿中央貼一片，外周可等距離貼若干片（外周一般可貼4-5片），每種藥敏片的名稱要記住。

6.4.3培養(yǎng)觀察

將平皿培養(yǎng)基倒置放于37℃溫箱中培養(yǎng)24小時(shí)以及48h后，觀察效果。

      

7.觀測(cè)指標(biāo)

7.1 藥敏實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，在涂有細(xì)菌的瓊脂平板上，抗菌藥物在瓊脂內(nèi)向四周擴(kuò)散，其濃度呈梯度遞減，因此在紙片周圍一定距離內(nèi)的細(xì)菌生長(zhǎng)受到抑制。過夜培養(yǎng)后形成一個(gè)抑菌圈，抑菌圈越大，說明該菌對(duì)此藥敏感性越大，反之越小，若無抑菌圈，則說明該菌對(duì)此藥具有耐藥性。其直徑大小與藥物濃度、劃線細(xì)菌濃度有直接關(guān)系。

7.2  藥物敏感實(shí)驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)參考表1，抑菌圈直徑在15mm以上為高敏，10mm以下為低敏，無抑菌圈為不敏。

表1 藥物敏感實(shí)驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)

8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表 2　藥敏試驗(yàn)結(jié)果

9. 影響藥敏結(jié)果的因素

9.1培養(yǎng)基：應(yīng)根據(jù)試驗(yàn)菌的營(yíng)養(yǎng)需要進(jìn)行配制。傾注平板時(shí)，厚度適合（約5-6mm），不可太薄，一般90mm直徑的培養(yǎng)皿，傾注培養(yǎng)基18-20ml為宜。

9.2細(xì)菌接種量：細(xì)菌接種量應(yīng)恒定，如果太多，抑菌圈變小。

9.3藥物濃度：藥物的濃度和總量直接影響抑菌試驗(yàn)的結(jié)果，需精確配制。

9.4培養(yǎng)時(shí)間：一般培養(yǎng)溫度和時(shí)間為37℃、12-24小時(shí)。但有些細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢，如副豬嗜血桿菌，要培養(yǎng)36-48h才能生長(zhǎng)良好，因此要推遲觀察時(shí)間，而得到準(zhǔn)確的抑菌圈。

10. 結(jié)論

在本實(shí)驗(yàn)中可以看到伊萊特（活性微礦）對(duì)大腸桿菌（19mm）、沙門氏菌（22mm）以及副豬嗜血桿菌（23mm）都有顯著的抑菌效果，達(dá)到了高敏藥物的效果，而對(duì)鏈球菌（4mm）效果不明顯。為何會(huì)有這樣的反差呢？分析發(fā)現(xiàn)伊萊特（活性微礦）在抑菌效果上的顯著表現(xiàn)，主要針對(duì)G－菌，而對(duì)G＋表現(xiàn)為不敏。

在生產(chǎn)中，應(yīng)選擇高敏藥物進(jìn)行改善，但有時(shí)候藥物的適口性相對(duì)較差，伊萊特（活性微礦）作為一種礦物質(zhì)可以避免這種情況，在給動(dòng)物預(yù)防和改善疾病的時(shí)候，通過積極飲食達(dá)到好的治改善果。