化學(xué)修飾的乳球蛋白（JB01-BD）陰道內(nèi)用藥的安全性評價
摘要：目前，國內(nèi)外仍缺乏針對HPV感染的特異性抗病毒療法。姜教授等人之前發(fā)現(xiàn)酸酐化修飾的蛋白可以抑制包括HPV在內(nèi)的多種病毒感染。本文評價了3-羥基鄰苯二甲酸酐修飾的牛β-乳球蛋白，也就是JB01，在高危HPV感染的女性患者中陰道內(nèi)用藥的安全性。通過在38位女性患者陰道使用JB01-BD 三個月，沒有發(fā)現(xiàn)任何的不良反應(yīng)發(fā)生。結(jié)果證實(shí)JB01-BD在HPV感染的女性陰道內(nèi)使用是安全的，為其阻斷HPV感染的應(yīng)用提供了實(shí)驗依據(jù)。
背景介紹
人乳頭瘤病毒HPV是屬于乳頭瘤病毒家族的一個DNA病毒。HPV通過感染人類皮膚和粘膜細(xì)胞建立持續(xù)性感染?，F(xiàn)在發(fā)現(xiàn)超過200種不同的HPV病毒，其中超過40種可以通過性傳播感染肛門和陰道。高危型HPV的持續(xù)性感染可以引發(fā)宮頸癌，宮頸癌已經(jīng)成為15歲到44歲之間女性的第二大惡性癌癥。大約80%的宮頸癌發(fā)生在發(fā)展中國家，中國每年約有135,000名女性感染者發(fā)展成宮頸癌。宮頸癌發(fā)病率的迅速增長急需研發(fā)出有效并且安全的抗HPV制劑。盡管HPV疫苗在許多國家已經(jīng)獲得批準(zhǔn)，但是很多發(fā)展中國家仍然沒有開始使用，包括中國。而且HPV疫苗的費(fèi)用較高，可預(yù)防的HPV種類也非常有限，這都限制了它的廣泛使用。目前很有必要研發(fā)出改善和預(yù)防HPV病毒感染的特異性制劑。
姜教授等人之前發(fā)現(xiàn)酸酐化修飾的蛋白具有廣譜的抗病毒活性，包括通過性傳播的人免疫缺陷病毒HIV，人皰疹病毒HSV和人乳頭瘤病毒HPV。因此，我們認(rèn)為這類酸酐化的蛋白可以被開發(fā)成為陰道或肛門內(nèi)使用的阻斷性傳播病毒感染的新型殺微生物劑。由于它們抗病毒能力廣譜，因此優(yōu)勢顯著，用途廣泛。然而，到目前為止，還沒有任何的研究證實(shí)這類酸酐化修飾的蛋白在人體內(nèi)使用的安全性，這就很大程度上限制了這類殺微生物劑的廣泛使用。文中，我們對3-羥基鄰苯二甲酸酐修飾的牛β-乳球蛋白，也就是JB01，在高危HPV感染的女性患者中陰道內(nèi)用藥的安全性進(jìn)行了評價。JB01已經(jīng)被山西錦波生物醫(yī)藥股份有限公司（中國，太原）的技術(shù)人員制成生物敷料稱為JB01-BD。
材料與方法
材料
JB01-BD，包含0.01%的JB01（化學(xué)修飾的牛β乳球蛋白）溶于生物敷料，來自山西錦波生物醫(yī)藥股份有限公司。JB01-BD的生產(chǎn)遵循藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（GMP）。生物敷料的主要成分為2%的卡波姆（carbomer）和2.5%的甘油，這兩種成分在美國食品藥品管理局的規(guī)定中認(rèn)定為安全無毒性的藥用添加劑。
倫理性陳述
本試驗已得到參與醫(yī)院的倫理委員會批準(zhǔn)。所有受試者均需簽訂書面知情同意書。臨床試驗選取非經(jīng)期、非孕期、非哺乳期患者。試驗在中國臨床試驗注冊中心注冊（ChiCTR-TRC-12002016）。
受試者
納入標(biāo)準(zhǔn)如下：25-65歲感染高危HPV的女性患者，且無高水平的宮頸病變（TCT法）。排除標(biāo)準(zhǔn)如下：對產(chǎn)品各組分過敏，肝腎功能異常，腫瘤惡化，免疫缺陷，陰道炎癥（滴蟲、霉菌或細(xì)菌感染），患有性病或其他影響試驗進(jìn)行的疾?。ㄒ泪t(yī)生的臨床經(jīng)驗判定）。
試驗設(shè)計
本實(shí)驗中，77名受試者按照計算機(jī)隨機(jī)種子數(shù)隨機(jī)分成JB01-BD組（38人）和空白對照組（39人），保證兩組間樣本的均一性。對改善組的受試者，JB01-BD（每劑量3g）每隔一天陰道涂抹一次，連續(xù)三個月，經(jīng)期不改善。非改善組在試驗中不進(jìn)行任何改善。所有受試者每月隨訪。JB01-BD組有38人完成試驗，對照組37人完成試驗，2人脫離。
安全性評價
每個受試者試驗前和試驗后都采集血樣，檢測血紅蛋白HB，白細(xì)胞計數(shù)WBC，血小板計數(shù)PLT，還有肝腎功能指標(biāo)，包括丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶ALT，天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶AST和肌酸酐Cr。同時，患者的尿樣也采集并檢測尿蛋白PRO，白細(xì)胞計數(shù)WBC和紅細(xì)胞計數(shù)RBC?；颊咴谠囼炃昂笠矙z測陰道微生態(tài)的各個指標(biāo)，包括陰道pH，陰道清潔度，細(xì)菌性陰道炎指標(biāo)，陰道灌洗液白細(xì)胞酯酶LE活性和陰道分泌物白細(xì)胞計數(shù)。陰道pH值大于4.5認(rèn)為異常。任何患者的感覺異常，包括灼燒、刺痛或者嚴(yán)重副作用，一旦發(fā)生立刻記錄。
數(shù)據(jù)分析
所有采納并隨機(jī)分組的受試者均采用均值和頻率計數(shù)方法描述。所有統(tǒng)計分析均使用SPSS（版本13.0）軟件。組間差異分析采用Rank Sum法或Chi-square法進(jìn)行。認(rèn)為P值小于0.05為具有統(tǒng)計學(xué)差異。
結(jié)果
在本次試驗中，沒有發(fā)現(xiàn)受試者出現(xiàn)任何的嚴(yán)重副反應(yīng)，包括灼燒、刺痛或者其他嚴(yán)重的癥狀。JB01-BD被普遍認(rèn)為在體內(nèi)感覺較為舒適，柔軟和濕潤。血尿檢測結(jié)果證實(shí)（表1），實(shí)驗組和對照組之間，不正常血尿指標(biāo)的比例沒有顯著性的差異（P > 0.05），除了尿紅細(xì)胞計數(shù)RBC（P = 0.019）。有趣的是，試驗前不正常的指標(biāo)，例如血紅蛋白HB，試驗后在JB01-BD組恢復(fù)到了正常。其它指標(biāo)，包括白細(xì)胞異常，血小板異常，血肌酐水平異常，尿紅細(xì)胞異常等，在試驗后的JB01-BD組里面都顯著性的降低。這些數(shù)據(jù)證實(shí)陰道內(nèi)使用JB01-BD沒有造成任何嚴(yán)重的副反應(yīng)，相反，一些異常的檢測指標(biāo)在JB01-BD組都趨向于恢復(fù)正常。
接下來，我們研究了JB01-BD對于陰道微生態(tài)的影響。試驗前，實(shí)驗組和對照組的陰道微生態(tài)都不正常（表2），包括細(xì)菌性的陰道炎，升高的陰道pH，陰道清潔度指標(biāo)的增高，陰道分泌物的白細(xì)胞計數(shù)異常，白細(xì)胞酯酶活性等等，這很有可能是由于HPV感染導(dǎo)致的。JB01-BD使用了3個月后，陰道pH的異常從63.2%降低到了7.9%，而對照組從54.1%只降低到了35.1%。類似的，其它陰道微生態(tài)指標(biāo)在JB01-BD組也比對照組有明顯的降低（P < 0.05）。這些結(jié)果證實(shí)JB01-BD具有改善陰道微生態(tài)環(huán)境的效果。
討論
目前，尚未有上市的針對HPV感染的特異性抗病毒藥物。手術(shù)切除、化學(xué)消融和冷凍改善等方法可以改善HPV感染引起的生殖器疣和宮頸癌等疾病，但如果HPV感染沒被控制，這些疾病很可能反復(fù)。為了研發(fā)安全的阻斷HPV感染的改善或預(yù)防的抗病毒制劑，我們首次開展了JB01-BD隨機(jī)開放的臨床試驗，用來評估它在高危HPV感染的女性中陰道內(nèi)使用的安全性。實(shí)驗中沒有發(fā)現(xiàn)任何嚴(yán)重的副反應(yīng)，所以陰道內(nèi)使用JB01-BD是安全的。實(shí)驗組和對照組中，異常血尿的百分比普遍沒有顯著性差異（P>0.05）。與口服和靜脈注射的抗病毒藥物不同的是，JB01-BD是陰道內(nèi)使用的，并沒有進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)，所以不會造成全身性的毒性反應(yīng)。
通常情況下，經(jīng)陰道給藥往往會造成瘙癢或異味的副反應(yīng)。然而，在本次臨床試驗中，沒有任何嚴(yán)重的副反應(yīng)出現(xiàn)，包括瘙癢、異味、灼燒、刺痛或其它嚴(yán)重癥狀。而且，沒有受試者出現(xiàn)對化學(xué)修飾蛋白JB01產(chǎn)生過敏反應(yīng)，所以沒有人因藥物過敏退出實(shí)驗。更重要的是，由于HPV感染導(dǎo)致的陰道微生態(tài)的異常，比如升高的陰道pH值，在JB01-BD使用后有明顯的改善。這說明JB01-BD通過阻斷HPV的感染改善了陰道微生態(tài)環(huán)境，恢復(fù)正常的陰道pH值。同樣的，JB01-BD組內(nèi)血尿異常比例也在試驗后明顯的降低，也很有可能歸因于HPV感染情況的改善。我們最近的研究也證實(shí)JB01-BD使用后，60.5%的HPV高危陽性的患者轉(zhuǎn)陰，而對照組織有13.5%的患者轉(zhuǎn)陰。
總之，利用3-羥基鄰苯二甲酸酐修飾的牛β-乳球蛋白制備的JB01-BD生物敷料，在38名女性陰道內(nèi)使用3個月期間，沒有發(fā)現(xiàn)任何的嚴(yán)重副反應(yīng)。相比對照組，實(shí)驗組中許多檢測的指標(biāo)都趨向于正常。實(shí)驗結(jié)果顯示，JB01-BD敷料在HPV感染的女性陰道內(nèi)使用是安全的，這為其改善HPV感染和預(yù)防多種性傳播病毒的感染提供了保障，包括HPV，HIV和HSV等。未來可以進(jìn)行更大人群的安全性和有效性實(shí)驗。
致謝
我們對參與本次臨床試驗的受試者表示深深的感謝，同時感謝中國人民解放軍總醫(yī)院的工作人員對受試者招募和數(shù)據(jù)分析的幫助。
利益沖突
陸路和姜世勃是相關(guān)專利的共同發(fā)明者，該專利為復(fù)旦大學(xué)和山西錦波生物醫(yī)藥股份有限公司共同享有。其他作者間均無利益沖突。
表1.實(shí)驗中受試者血尿指標(biāo)
|
指標(biāo) |
指標(biāo)異常人數(shù) （%） |
|||||
|
試驗前 |
試驗后 |
|||||
|
JB01-BD組 |
對照組 |
P |
JB01-BD組 |
對照組 |
P |
|
|
血紅蛋白 （Hb） |
5 （13.2%） |
3 （8.1%） |
0.479 |
0 （0.0%） |
3 （8.1%） |
0.073 |
|
血白細(xì)胞 （WBC） |
6 （15.8%） |
3 （8.1%） |
0.306 |
0 （0.0%） |
3 （8.1%） |
0.073 |
|
血小板 （PLT） |
5 （13.2%） |
6 （16.2%） |
0.708 |
1 （2.6%） |
4 （10.8%） |
0.156 |
|
丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶 （ALT） |
3 （7.9%） |
1 （2.7%） |
0.317 |
1 （2.6%） |
2 （5.4%） |
0.540 |
|
天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶 （AST） |
2 （5.3%） |
0 （0.0%） |
0.157 |
1 （2.6%） |
0 （0.0%） |
0.321 |
|
血肌酸酐（Cr） |
9 （23.6%） |
6 （16.2%） |
0.933 |
4 （10.5%） |
7 （18.9%） |
0.190 |
|
尿蛋白（PRO） |
1 （2.6%） |
0 （0.0%） |
0.321 |
0 （0.0%） |
0 （0.0%） |
N/A |
|
尿白細(xì)胞計數(shù)（WBC） |
0 （0.0%） |
0 （0.0%） |
N/A |
1 （2.6%） |
0 （0.0%） |
0.321 |
|
尿紅細(xì)胞計數(shù) （RBC） |
5 （13.2%） |
6 （16.2%） |
0.708 |
0 （0.0%） |
5 （13.5%） |
0.019 |
表2. JB01-BD對于陰道微生態(tài)的影響
|
指標(biāo) |
陰道樣本指標(biāo)異常人數(shù) （%） |
|||||
|
試驗前 |
P |
試驗后 |
P |
|||
|
JB01-BD組 |
對照組 |
JB01-BD組 |
對照組 |
|||
|
陰道pH |
24 （63.2%） |
20 （54.1%） |
0.423 |
3 （7.9%） |
13 （35.1%） |
0.004 |
|
細(xì)菌性陰道炎 |
8 （21.1%） |
9 （24.3%） |
0.679 |
0 （0.0%） |
8 （21.6%） |
0.002 |
|
陰道清潔度 |
31 （81.6%） |
30 （81.1%） |
0.992 |
17 （44.7%） |
36 （97.3%） |
＜0.001 |
|
陰道分泌物白細(xì)胞計數(shù) |
32 （84.2%） |
33 （89.2%） |
0.814 |
26 （68.4%） |
35 （94.6%） |
0.015 |
|
白細(xì)胞酯酶活性 |
29 （76.3%） |
34 （91.9%） |
0.112 |
22 （57.9%） |
36 （97.3%） |
＜0.001 |
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