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抗HPV生物蛋白敷料JB01-BD陰道內(nèi)用藥改善高危HPV感染的

隨機(jī)開放性臨床試驗(yàn)

摘要：目前，國內(nèi)外仍缺乏針對HPV感染的特異性抗病毒療法。通過隨機(jī)開放性臨床試驗(yàn)，我們檢測了中國山西錦波生物醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)的抗HPV生物蛋白敷料JB01-BD對HPV感染的治改善果。試驗(yàn)中，77位高危HPV陽性的受試女性患者被隨機(jī)分成改善組和非改善組。試驗(yàn)結(jié)束后，在JB01-BD改善組中約60.5%（23/38）的女性HPV病毒載量轉(zhuǎn)陰，而在對照組中僅有13.5%的患者轉(zhuǎn)陰（5/37）（P＜0.001）。臨床研究結(jié)果證實(shí)JB01-BD是改善HPV感染的一種有效的局部用生物制劑。

1. 背景介紹

宮頸癌是女性第四大常見的癌癥，全球每年死于宮頸癌的人數(shù)超過266,000人。80%的宮頸癌發(fā)生在發(fā)展中國家，在這些國家里，宮頸癌是造成15-44周歲女性第二高死亡率的癌癥類型。在中國，每年約有135,000名女性發(fā)展成宮頸癌，因之喪生的人數(shù)也高達(dá)50,000人。這些數(shù)據(jù)表明宮頸癌的發(fā)生率正呈現(xiàn)快速增長的趨勢，嚴(yán)重威脅女性健康。因此，開發(fā)預(yù)防宮頸癌的安全有效的生物制劑迫在眉睫。

我們已知高危人乳頭瘤病毒（HPV）是引發(fā)宮頸癌的元兇，其致病機(jī)制目前已較為清楚。HPV是一種無包膜雙鏈小DNA病毒，其基因組可分為三個(gè)區(qū)域：E區(qū)域（包含早期基因E1-E7），L區(qū)域（包含晚期基因L1和L2），以及LCR區(qū)域（長控制區(qū)）。HPV常被分為高危型和低危型兩種類型，可以感染口腔、手足和生殖器等器官的上皮細(xì)胞或粘膜組織。當(dāng)皮膚或粘膜受損，HPV病毒顆粒可以穿透人體物理屏障，直接與上述組織基底細(xì)胞接觸。因此，HPV病毒的生存周期為阻止HPV感染、預(yù)防宮頸癌發(fā)生提供了最好的干預(yù)機(jī)會。迄今為止，市場上還沒有特異性針對HPV感染的抗病毒改善方法。HPV疫苗在很多國家被批準(zhǔn)上市，但包括中國在內(nèi)的很多發(fā)展中國家還沒有開始使用這類疫苗，主要是因?yàn)檫@類疫苗價(jià)格高昂，且預(yù)防的HPV亞型種類有限。因此，亟待開發(fā)出特異性預(yù)防和改善HPV感染的有效制劑。

科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，酸酐化蛋白針對許多病毒都具有廣譜的抗病毒活性。其中，3-羥基鄰苯二甲酸酐修飾的牛β-乳球蛋白對高危型和低危型HPV感染都顯示出高效的抗病毒作用。此外，該制劑價(jià)格適中，且在溶液中高度穩(wěn)定，很容易制成局部用凝膠制劑。

最近，中國太原市山西錦波生物醫(yī)藥股份有限公司將這種化學(xué)修飾蛋白（名稱為JB01）制作成生物敷料產(chǎn)品（縮寫為JB01-BD）。本文中，我們利用隨機(jī)開放性臨床試驗(yàn)，評估了JB01-BD在高危HPV陽性的女性患者中臨床治改善果。

2. 材料與方法

2.1 材料

JB01-BD，包含0.01%的JB01（化學(xué)修飾的牛β-乳球蛋白）溶于生物敷料，來自山西錦波生物醫(yī)藥股份有限公司。JB01-BD的生產(chǎn)遵循藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（GMP）。生物敷料的主要成分為2%的卡波姆（Carbomer）和2.5%的甘油，這兩種成分在美國食品藥品管理局的規(guī)定中認(rèn)定為安全無毒性的藥用添加劑。根據(jù)中國HPV感染改善規(guī)范，目前沒有其他可使用的替代藥物作為本實(shí)驗(yàn)的對照組。而且，通過嘗試發(fā)現(xiàn)無法制作出不含JB01有效成分但與JB01-BD外形感覺都完全相同的安慰劑對照品。因此，本試驗(yàn)中的對照組定為不接受任何改善。

2.2 受試者

本試驗(yàn)已得到參與醫(yī)院的倫理委員會批準(zhǔn)。所有受試者均需簽訂書面知情同意書，納入標(biāo)準(zhǔn)如下：25-65歲感染高危HPV的女性患者，感染HPV類型為16,18,31,33,35,39,45,51,52, 56,58,59和68，且無高級別宮頸病變。排除標(biāo)準(zhǔn)如下：對產(chǎn)品各組分過敏，肝腎功能異常，腫瘤惡化，免疫缺陷，陰道炎癥（滴蟲、霉菌或細(xì)菌感染），患有性病或其他影響試驗(yàn)進(jìn)行的疾?。ㄒ泪t(yī)生的臨床經(jīng)驗(yàn)判定）。臨床試驗(yàn)選取非經(jīng)期、非孕期、非哺乳期患者。受試者均自愿參與本試驗(yàn)，并在試驗(yàn)前簽署知情同意書。

2.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

為評估JB01-BD作為局部性藥物改善宮頸部位感染不同高危HPV亞型的藥效，我們選取中國兩所醫(yī)院開展隨機(jī)開放性I/IIa階段臨床試驗(yàn)。試驗(yàn)在中國臨床試驗(yàn)注冊中心注冊（注冊號ChiCTR-TRC-12002016）。根據(jù)電腦隨機(jī)編號系統(tǒng)生成相同樣本量的兩組種子數(shù)，將受試者隨機(jī)分為改善組和對照組。改善前，根據(jù)HPV檢測試劑盒說明書檢測每位受試者的HPV病毒的DNA載量（HC2法，美國Digene公司）。宮頸陰道樣品溶液的HPV病毒檢測信號以相對光單位RLU表示，與試劑盒提供的陽性對照平均陽性信號值對比。RLU/CO值大于或等于1表示陽性，對應(yīng)的濃度為1pg/ml。改善組的受試者接受JB01-BD（每劑量3g）改善，每隔一天宮頸涂抹一次，連續(xù)三個(gè)月，經(jīng)期停用。非改善組在試驗(yàn)中不進(jìn)行任何改善，隨訪觀察。所有受試者每月隨訪，三個(gè)月后，再次測定HPV病毒的DNA載量。

2.4 數(shù)據(jù)分析

所有入組并隨機(jī)分組的受試者均采用均值和頻率計(jì)數(shù)方法描述。所有統(tǒng)計(jì)分析均使用SPSS（版本13.0）軟件。組間差異分析采用Rank Sum法或Chi-square法進(jìn)行。認(rèn)為P值小于0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3. 結(jié)果

3.1  受試者參與情況

本試驗(yàn)共納入77名受試者，其中38名接受JB01-BD改善，39名未接受改善。其中改善組的38名受試者全部完成了整個(gè)改善過程，而非改善組中有37名受試者完成了試驗(yàn)過程，另外兩名中途脫組。改善組與非改善組的年齡分布無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.479）。

3.2  JB01-BD能顯著降低HPV感染女性的陽性率

從表1結(jié)果可見，改善組的38名受試者在接受JB01-BD改善后，15名（39.5%）仍顯示HPV陽性（HPV病毒的DNA載量陽性），也就是60.5%的HPV陽性受試者在JB01-BD改善結(jié)束后，呈現(xiàn)HPV陰性。而非改善組的37名HPV感染者中仍有32名受試者呈現(xiàn)HPV陽性，只有13.5%的受試者體內(nèi)的HPV由陽性轉(zhuǎn)為陰性。組間統(tǒng)計(jì)學(xué)分析Chi-square結(jié)果為17.71，證明兩組結(jié)果存在顯著性差異（P＜0.001）。因此，我們的結(jié)果說明JB01-BD可以有效抑制HPV的感染和復(fù)制，使HPV感染患者轉(zhuǎn)陰。

3.3  JB01-BD能顯著降低HPV感染女性的DNA載量

采用HC2方法檢測每名受試者的HPV DNA載量。如表2所示，試驗(yàn)前，改善組受試者HPV DNA平均載量為19.80 RLO/CO，非改善組該數(shù)值為13.16 RLO/CO。根據(jù)Rank sum測試，兩組該結(jié)果無顯著性差異（Z score=0.618；P=0.537）。但在試驗(yàn)后，兩組受試者的所有檢測指標(biāo)均產(chǎn)生顯著性差異（P＜0.001）。38名接受JB01-BD改善的受試者平均HPV DNA載量降到了0.76 RLU/CO（陰性），而非改善組的HPV DNA平均載量仍保持在高水平22.25 RLU/C（陽性）。改善組HPV DNA載量平均降低了88.42%，而非改善組平均升高了5.55%。

從表3可見，根據(jù)數(shù)值大小將HPV DNA載量可以分為5個(gè)級別：＜1（陰性）；1-9.9；10-99.9；100-999.9；≧1000 RLU/CO。在試驗(yàn)前，每組受試者的HPV DNA載量均為陽性。而且在兩組中，所有4個(gè)級別的受試者的數(shù)量分布也無顯著性差異（χ²=1.227，P=0.746）。而在試驗(yàn)后，兩組的5個(gè)級別受試者的分布產(chǎn)生了顯著性差異（χ²=42.326，P＜0.001）。在JB01-BD改善組，38名受試者主要分布于低病毒載量級別，其中60.5%的受試者HPV DNA載量已低于1 RLU/CO（陰性）。而非改善組的37名受試者主要分布于高病毒載量級別（32.4%分布在10-99.9 RLU/CO級，24.3%分布在1-9.9 RLU/CO級）。因此，我們的結(jié)果證明應(yīng)用JB01-BD改善可以顯著降低HPV DNA載量，直至達(dá)到HPV DNA陰性。

4. 討論

目前，尚未有上市的針對HPV感染的特異性抗病毒藥物。手術(shù)切除、化學(xué)消融和冷凍改善等方法可以改善HPV感染引起的生殖器疣和宮頸癌等疾病，但如果HPV感染沒被控制，這些疾病很可能反復(fù)。美國FDA授權(quán)的三種HPV預(yù)防性疫苗（卉妍康、加德西和加德西9）已被推薦給所有9-26周歲的女性使用，但對于26周歲以上的女性，這些疫苗不能有效預(yù)防HPV感染。此外，它們也無法改善已經(jīng)感染HPV的女性患者。這三種疫苗還未能提供給包括中國在內(nèi)的很多發(fā)展中國家。因此，研發(fā)改善和/或預(yù)防HPV感染的有效抗病毒藥物迫在眉睫。

我們之前的研究證明JB01在體外可以阻止HPV進(jìn)入靶細(xì)胞，機(jī)制可能是通過JB01表面的負(fù)電荷氨基酸與L1和/或L2蛋白的正電荷氨基酸的相互作用。但JB01通過陰道/宮頸涂抹的方式是否能夠安全有效的改善高危HPV感染仍不清楚。在此我們利用隨機(jī)開放性臨床試驗(yàn)，在感染了高危HPV的女性患者中采用山西錦波生物醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)的抗HPV生物蛋白敷料JB01-BD進(jìn)行改善，并評估了此敷料對改善25-60周歲HPV感染女性的有效性和安全性。JB01-BD與口服類或靜脈注射類抗病毒藥物不同，它直接涂抹在陰道/宮頸壁上。這樣JB01無法進(jìn)入血液循環(huán)，因此不會造成系統(tǒng)性毒性。試驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)，在這次為期3個(gè)月的隨機(jī)臨床試驗(yàn)中，38名受試者每隔一天采用JB01-BD（每劑量3g）陰道用藥，整個(gè)過程并未發(fā)現(xiàn)該藥物有明顯的毒副作用。

上述臨床結(jié)果證明，JB01-BD可以有效控制HPV感染，約60.5%（23/38）的HPV陽性患者在接受改善后呈現(xiàn)HPV陰性，而非改善組中只有13.5%（5/37）的患者由HPV陽性轉(zhuǎn)為陰性（表1）。此外，JB01-BD也可以有效的降低HPV DNA載量。HPV陽性（或稱HPV感染）定義為檢測到HPV DNA載量≥1.00 RLU/CO，HPV陰性定義為HPV DNA載量＜1.00 RLU/CO。在我們的試驗(yàn)中，改善組受試者的平均HPV DNA載量由19.8 RLU/CO降到了0.76 RLU/CO，而非改善組的HPV DNA載量反而從13.16 RLU/CO上升到22.24 RLU/CO（表2）。盡管仍有39.5%的受試者在改善后仍顯示HPV陽性，但她們體內(nèi)的病毒載量已經(jīng)顯著低于非改善組的受試者（χ²=42.326，P＜0.001）（表3）。這說明JB01-BD改善HPV感染患者不僅可以顯著降低HPV陽性率，還能有效降低HPV DNA病毒載量。因此，JB01-BD是一種抗HPV安全有效的改善性藥物，同時(shí)也可以用于對HPV的預(yù)防。 

致謝

我們對參與本次臨床試驗(yàn)的受試者表示深深的感謝，同時(shí)感謝中國人民解放軍總醫(yī)院的工作人員對受試者招募和數(shù)據(jù)分析的幫助。本試驗(yàn)由山西錦波生物醫(yī)藥股份有限公司贊助。JB01和JB01-BD的體外試驗(yàn)由主要感染性疾病國家重大專項(xiàng)基金支持。

附錄A：補(bǔ)充材料

本文補(bǔ)充材料可在以下網(wǎng)址中查看http://dx.doi.org/10.1016/j.micinf.2015.10.004

利益沖突

陸路和姜世勃是相關(guān)專利的共同發(fā)明者，該專利為復(fù)旦大學(xué)和山西錦波生物醫(yī)藥股份有限公司共同享有。其他作者間均無利益沖突。

圖表

表1：JB01-BD改善前后HPV感染女性HPV陽性率對比

表2：JB01-BD對于降低HPV感染女性的HPV DNA載量作用明顯

表3：JB01-BD改善前后HPV感染女性宮頸部位HPV DNA載量變化

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