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化學(xué)修飾的牛β-乳球蛋白可抑制人乳頭瘤病毒感染

摘要：既往研究顯示，3-羥基鄰苯二甲酸酐修飾的牛β-乳球蛋白有望成為新的抗-HIV殺微生物劑。本研究發(fā)現(xiàn)，這一被命名為JB01的化學(xué)修飾蛋白在抗人乳頭瘤病毒（HPV）感染中表現(xiàn)出高效的抗病毒活性，包括HPV 6、HPV 16和HPV 18三種亞型。JB01的抗HPV活性與其表面賴氨酸和精氨酸殘基的修飾比例緊密相關(guān)。JB01蛋白在濃度為1 mg/ml時(shí)無任何細(xì)胞毒性，且在室溫和37℃條件下均保持不少于12周的高度穩(wěn)定性。這些結(jié)果表明，JB01極有望被開發(fā)成為一種安全、有效且低廉的抗病毒制劑，用于HPV感染的改善和預(yù)防。

關(guān)鍵詞：3-羥基鄰苯二甲酸酐；化學(xué)修飾；牛β-乳球蛋白；HPV感染；子宮頸癌；抗-HPV制劑

1. 引言

從全球而言，子宮頸癌是女性中第三大高發(fā)癌癥，每年約有274,000例女性死于該病[1]。在發(fā)展中國家，這一情況更為嚴(yán)重，子宮頸癌在15-44歲女性癌性死亡原因中名列第2[2]。在中國，每年約有135,000例新發(fā)子宮頸癌女性患者，近50,000例患者死于該病，約占全球死亡總數(shù)的18%[3]。特別是近10年來，子宮頸癌發(fā)病率迅速升高，嚴(yán)重威脅中國女性的健康。因此，亟需研發(fā)出一種安全、有效的生物制劑，用以預(yù)防子宮頸癌發(fā)生。

人乳頭瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）是目前公認(rèn)的造成子宮頸癌的罪魁禍?zhǔn)譡4]。HPV是一種無包膜小病毒，大小約為55nm，內(nèi)含雙鏈DNA。整個(gè)基因組由三個(gè)區(qū)域組成。E和L域分別控制早期和晚期病毒復(fù)制，而LCR域則負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)基因功能[5]。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)超過100種不同亞型的HPV，它們可以進(jìn)一步劃分為高危型和低危型[6]。鑒于HPV 6和11主要會(huì)引起良性生殖器疣和輕度宮頸上皮壞死，故將其歸為低危型HPV。相反， HPV 16和HPV 18被列為高危型，因?yàn)樗鼈兛梢l(fā)超過總數(shù)的70%以上的子宮頸癌[7，8]。

HPV通常會(huì)感染人皮膚和粘膜組織復(fù)層上皮的基底細(xì)胞，特別是在口、手、足和生殖器部位。病毒與人類細(xì)胞間的直接接觸是病毒入侵的必要條件。當(dāng)皮膚或粘膜受損時(shí)，游離的成熟HPV顆粒即有機(jī)會(huì)穿透輕微創(chuàng)傷部位，與組織細(xì)胞結(jié)合而感染。一般而言，這就是HPV生命周期的開始，同時(shí)也是預(yù)防病毒感染的最佳階段。HPV預(yù)防性疫苗現(xiàn)已在100多個(gè)國家獲批[9]。盡管如此，因其改善費(fèi)用高且不能有效預(yù)防所有HPV亞型，導(dǎo)致其在低收入、發(fā)展中國家應(yīng)用受限。此外，目前還沒有任何一種可局部抑制HPV感染的制劑，因此研發(fā)此類制劑勢在必行。

我們的既往研究顯示，3-羥基鄰苯二甲酸酐修飾的牛β-乳球蛋白，即本文中的JB01，可有效抑制HIV、HSV-1、HSV-2、以及某些衣原體[10-13]。本研究中針對(duì)JB01蛋白抑制HPV感染的活性進(jìn)行了檢測。結(jié)果證實(shí)，JB01具有高效的抗病毒活性，可有效抑制HPV6、HPV16和HPV18感染。我們的既往研究還表明，該化學(xué)修飾蛋白不僅價(jià)格低廉，且在水溶液中高度穩(wěn)定，易于制成外用凝膠制劑[10，14]。因此，我們相信，JB01有望被進(jìn)一步開發(fā)成為一種安全、有效且價(jià)格低廉的外用生物制劑，用于HPV感染的預(yù)防和改善。

2. 材料和方法

2.1  試劑

自Sigma公司（圣路易斯，密蘇里州，美國）購買3-羥基鄰苯二甲酸酐、牛β-乳球蛋白、胰蛋白酶-瓊脂糖珠、XTT [2,3-雙（2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯）-5-[（苯胺基）羧基]-2氫-四唑氫氧化物]和2,4,6-三硝基苯磺酸（trinitrobenzenesulfonic acid，TNBS），自Fisher Scientific 公司（Valley Park，VA）購買對(duì)一水合羥苯基乙二醛。TZM-b1細(xì)胞，是人工改造的高度表達(dá)CD4及兩種共受體CXCR4和CCR5的HeLa-細(xì)胞系、同時(shí)還穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了長末端重復(fù)序列（LTR）-驅(qū)動(dòng)螢火蟲熒光素酶；293FT細(xì)胞，一種含SV40大T抗原可快速生長的293T細(xì)胞系變種，均由美國國立衛(wèi)生研究院下屬的艾滋病研究與相關(guān)試劑組提供。VK2/E6E7細(xì)胞（一種永生化陰道上皮細(xì)胞系）購自美國菌種保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）（弗吉尼亞，馬納薩斯）。

2.2  JB01制備和鑒別

利用先前描述的方法制備JB01蛋白[10]。簡言之，即將牛β-乳球蛋白溶于0.1 M磷酸鹽緩沖液（pH 8.5），配制成最終濃度為20 mg/ml的溶液。之后將3-羥基鄰苯二甲酸酐二甲基甲酰胺飽合溶液緩慢加入該溶液內(nèi)并輕輕搖動(dòng)。將溶液分為5份，分別配制成3-羥基鄰苯二甲酸酐最終濃度為0、10、20、40和60 mM的溶液（如表1所示）。將混合物放在室溫下靜置1 h，經(jīng)磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）充分透析后，利用0.45 μm 注射器式過濾器（Acrodisc；Gelman Sciences，Ann Arbor，MI）進(jìn)行過濾。采用BCA蛋白定量分析試劑盒（Pierce，Rockford，IL）測定蛋白濃度。

采用如前所述的TNBS分析法，定量測定修飾后或未修飾的蛋白中賴氨酸殘基比例[15]。簡言之，即在室溫（room temperature，RT）下，用25 μl Na₂B₄O₇（0.1 M）處理25 μl 酸酐修飾或未修飾蛋白（90 μM）5 min。之后將10 μl TNBS加入混合物內(nèi)。再過5 min后，加入100 μl終止液（0.1M NaH₂PO₄和1.5mM Na₂SO₃）終止反應(yīng)。利用酶標(biāo)儀（Ultra 384；Tecan，Research Triangle Park，NC）測定420 nm（A420）處吸光度。另外，采用先前的描述方法，檢測精氨酸殘基修飾比例[16]。簡言之，即將90 μl酐修飾或未修飾蛋白（90 μM）溶于0.1 M 磷酸鈉溶液（pH 9.0），之后用10 μl 50 mM p-HPG在RT、黑暗條件下處理90 min。測定340 nm（A340）處吸光度。

2.3  JB01對(duì)HPV感染抑制活性的檢測

采用先前所述方法，將含密碼子修飾HPV L1和L2基因共轉(zhuǎn)染至293FT細(xì)胞內(nèi)，生成HPV假病毒[17]。之后，在37 ℃條件下用JB01或?qū)φ盏鞍讓?duì)100個(gè)TCID₅₀（50%組織培養(yǎng)感染量）HPV 6、HPV 16和HPV 18假病毒進(jìn)行30 min孵化。再將混合物加至含10% FBS DMEM培養(yǎng)基內(nèi)的1×10⁵/ml 293FT 細(xì)胞內(nèi)，過夜。第2天，去除培養(yǎng)上清液，加入新鮮培養(yǎng)基。感染后第3天，收集細(xì)胞并50 μl裂解試劑進(jìn)行裂解。利用熒光素酶試劑盒（Promega，Madison，WI）和光度計(jì)（Ultra 386；Tecan，Durham，NC），參照產(chǎn)品說明書，完成熒光素酶活性分析測定。利用CalcuSyn軟件計(jì)算JB01的IC_50s[18]。

2.4 細(xì)胞毒性分析

利用如前所述的XTT比色法，測定JB01對(duì)TZM-b1和VK2/E6E7細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞毒性[19，20]。簡言之，即利用含等容積（10⁵個(gè)細(xì)胞/ml）細(xì)胞的96-孔板，將各級(jí)別濃度100μl復(fù)合物加入孔中的細(xì)胞內(nèi)。在37 ℃條件下孵化4天后，加入含0.02 μM吩嗪硫酸甲酯的50 μl XTT溶液（1 mg/ml）。經(jīng)過4 h后，利用酶標(biāo)儀測定450 nm處吸光度，并計(jì)算細(xì)胞毒性比例。

3. 結(jié)果

3.1  3-羥基鄰苯二甲酸酐修飾帶正電賴氨酸和精氨酸殘基比例與JB01的抗-HPV活性相關(guān)

β-乳球蛋白含有162個(gè)殘基，分子量為18.4 kDa，內(nèi)含18個(gè)帶正電殘基，包括15個(gè)賴氨酸殘基和3個(gè)精氨酸殘基。我們的既往研究證明，JB01上化學(xué)修飾賴氨酸殘基數(shù)量是其抗-HIV-1活性的重要決定因素[21]。本研究也證實(shí)，無論是賴氨酸還是精氨酸殘基的比例，都對(duì)JB01的抗-HPV活性有重要意義。如表1所示，隨著3-羥基鄰苯二甲酸酐濃度的升高，賴氨酸和精氨酸殘基被修飾的數(shù)量逐漸增加，JB01抗-HPV活性亦隨之增強(qiáng)。采用60 mM 3-羥基鄰苯二甲酸酐處理時(shí)，分別約有90%和95%的賴氨酸和精氨酸殘基被修飾，可產(chǎn)生最強(qiáng)的HPV 16感染抑制作用（IC₅₀ = 0.027 μM）。因此，后續(xù)的研究均采用這一濃度的3-羥基鄰苯二甲酸酐完成β-乳球蛋白的修飾處理。

3.2  JB01可有效抑制HPV6、HPV 16和HPV18感染

接下來的研究檢測了JB01對(duì)可導(dǎo)致生殖器疣的HPV 6及公認(rèn)的可導(dǎo)致子宮頸癌的高危型HPV16和HPV18的抑制活性[7，8]。如圖1所示，對(duì)于所有這三種HPV亞型，即HPV6、HPV 16和HPV 18，JB01都表現(xiàn)出了高效的抗病毒活性，IC₅₀分別為0.33、0.04、和0.065 μM。這些結(jié)果表明，JB01可有效抑制導(dǎo)致人類疾病的主要的HPV亞型。

3.3  JB01穩(wěn)定且細(xì)胞毒性低

作為可應(yīng)用于臨床的產(chǎn)品，抗-HPV制劑的穩(wěn)定性和安全性是其研發(fā)中要解決的重要問題。在評(píng)價(jià)JB01穩(wěn)定性時(shí)，我們分別將JB01蛋白在室溫（24℃）及人體溫（37℃）溫度條件下放置12周，并于第1、2、3、4、6、和12周時(shí)測定其抗-HPV活性。結(jié)果顯示，12周貯藏期內(nèi)，JB01抗-HPV活性無顯著變化，即證明JB01高度穩(wěn)定（圖2A）。

之后，研究又利用未修飾β-乳球蛋白作為對(duì)照組，進(jìn)一步評(píng)價(jià)了JB01對(duì)人宮頸癌細(xì)胞系（HeLa細(xì)胞）衍生TZM-b1細(xì)胞和VK2/E6E7細(xì)胞（陰道上皮細(xì)胞）的細(xì)胞毒性。如圖2B所示，JB01對(duì)上述人宮頸細(xì)胞和陰道上皮細(xì)胞無明顯細(xì)胞毒性，這意味著它和未修飾β-乳球蛋白一樣安全。

4. 討論

雖然HPV并不會(huì)感染未受損粘膜上皮細(xì)胞，但可感染受損粘膜上皮細(xì)胞。在其衣殼蛋白L1和L2作用下，該病毒可通過獨(dú)特機(jī)制感染復(fù)層上皮的基底細(xì)胞。首先，L1蛋白與上皮損傷后暴露基底膜（basement membrane，BM）上的硫酸乙酰肝素蛋白多糖（heparan sulfate proteoglycan，HSPG）結(jié)合，引發(fā)弗林蛋白酶切割L2蛋白，并與L1結(jié)合后在角質(zhì)化細(xì)胞表面形成尚未明確的受體，進(jìn)而引發(fā)新的復(fù)制循環(huán)[22]。因此，采用含抗-HPV成分外用制劑涂抹生殖器粘膜表面這一方法有望阻斷新的HPV感染，籍此有效預(yù)防和改善HPV感染。

由于L1和L2蛋白表達(dá)要求復(fù)層鱗狀上皮組織的上層出現(xiàn)細(xì)胞分化[22]，因此HPV無法在常規(guī)單層細(xì)胞培養(yǎng)中復(fù)制。但可利用基于HPV的假病毒對(duì)HPV生命周期的早期進(jìn)行觀察[17]。本研究采用HPV假病毒系統(tǒng)評(píng)價(jià)了JB01對(duì)293FT細(xì)胞HPV感染的抑制活性。研究發(fā)現(xiàn)，JB01可高效抑制多種類型HPV感染，包括HPV 6、HPV 16和HPV 18。JB01內(nèi)修飾賴氨酸和精氨酸殘基的比例與其抗-HPV活性密切相關(guān)，這意味著JB01的凈負(fù)電荷在JB01介導(dǎo)HPV感染抑制效應(yīng)中具有重要作用。這些結(jié)果表明，JB01可通過β-乳球蛋白上帶負(fù)電殘基與L1和/或L2蛋白上帶正電殘基的交互作用，阻止HPV進(jìn)入靶細(xì)胞內(nèi)。據(jù)此我們推測，L1蛋白的C末端結(jié)構(gòu)域與L2蛋白的N-末端結(jié)構(gòu)域有可能是JB01的作用靶點(diǎn)，因?yàn)檫@兩個(gè)結(jié)構(gòu)域都含有暴露于病毒衣殼表面的帶正電殘基[23,24]。事實(shí)上，研究亦發(fā)現(xiàn)，JB01可與HPV L1和L2蛋白上的帶正電殘基牢固結(jié)合，而未修飾β-乳球蛋白與這些肽間未觀察到明顯的結(jié)合作用。

總之，本研究證明，作為一種表面負(fù)電荷量相對(duì)增多（對(duì)帶正電殘基進(jìn)行化學(xué)修飾的結(jié)果）的化學(xué)修飾β-乳球蛋白，JB01可有效抑制HPV感染，其機(jī)制很可能是靶向作用于病毒復(fù)制早期、特別是病毒進(jìn)入過程。作為一種廉價(jià)、安全且穩(wěn)定的抗-HPV劑，可將JB01制成外用凝膠制劑，用于生殖粘膜HPV感染的預(yù)防和改善，進(jìn)而降低子宮頸癌的發(fā)病率。

致謝

感謝美國國立衛(wèi)生研究院Dr. John為我們提供用以制備HPV 6、HPV 16和HPV 18假病毒的質(zhì)粒。感謝美國國立衛(wèi)生研究院下屬的艾滋病研究與相關(guān)試劑組為我們提供TZM-bl細(xì)胞和293FT細(xì)胞。本研究由中國國家自然科學(xué)基金（81173098 SJ＃81102476 LL）、中國973計(jì)劃（＃2012CB519001 SJ）及“Chen Guang” Project of SMEC and SEDF（11CG03）to LL資助。

圖釋

圖1. JB01對(duì)HPV感染的抑制活性，包括HPV6（A）、HPV16（B）和HPV18（C）病毒。將標(biāo)本分成將標(biāo)本分成3份完成測定，并重復(fù)實(shí)驗(yàn)至少2次。圖中數(shù)據(jù)為代表性實(shí)驗(yàn)三份測定值的均數(shù)± SD。

圖2. JB01的穩(wěn)定性和細(xì)胞毒性。（A）JB01的穩(wěn)定性。分別將JB01放置在24和37℃條件下貯存1-12周，各指示時(shí)點(diǎn)其抗HPV6（a）、HPV16（b）和HIV18（c）感染的抗病毒活性如圖所示。（B）JB01的細(xì)胞毒性。采用XTT比色法測定JB01對(duì)TZM-B1細(xì)胞（d）和VK2/E6E7細(xì)胞（e）的可能毒性反應(yīng)。利用未修飾β-乳球蛋白作為對(duì)照。將標(biāo)本分成3份完成測定，并重復(fù)實(shí)驗(yàn)至少2次。圖中數(shù)據(jù)為代表性實(shí)驗(yàn)三份測定值的均數(shù)± SD。

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